细胞增殖可用于评估正常细胞的健康状况、测定对毒性损伤的反应或用作多种癌症的预后和诊断工具。传统上，在对增殖标记（例如Ki67，BrdU或增殖细胞核抗原）进行免疫组织化学染色后，通过人工计数阳性和阴性细胞进行细胞增殖活性检测。组织切片数字化的发展使病理切片的获取更加方便，也改变了传统的阅片方式。更重要的，大数据样本的数字病理切片的积累，有助于深度学习算法在病理分析中得到广泛的应用。
基于深度学习卷积神经网络(CNN)的HALO-AI人工智能平台，非常适合病理图像分类应用。通过对HALO-AI进行算法训练，在不同类型肿瘤的细胞增殖进行量化，可有效地节省病理医生资源，并可大幅减少不同病理专家之间带来的评估差异性。HALO-AI更是提供了简便，可视化的操作界面，无需高级的编程技能，便可快速的应用到病理学领域的评估中。本期我们将描述如何利用HALO-AI3.0平台对大鼠乳腺和小型猪输卵管的全组织切片进行分析，定量评估组织内上皮细胞增殖活性。
方法与结果
大鼠乳腺细胞增殖活性评估：共纳入31只雌性Sprague-Dawley大鼠，分成6组。其中组1和组4为对照组；组2和组5每天用nmol/kg的人胰岛素治疗一次；组3和组6每天用20μg雌二醇和4mg孕酮治疗一次。大鼠乳腺组织样本取样后用BrdU抗体进行免疫组化染色。
小型猪输卵管细胞增殖活性评估：从先前4个不同的毒理学研究中共纳入18只雌性哥廷根迷你猪，分别是经药物治疗的对照组动物和经药物治疗的恢复期对照组动物。小型猪输卵管组织样本取样后用Ki67抗体进行免疫组化染色。
染色后的组织样本用数字化扫描仪进行全组织玻片扫描，随后导入HALO数字病理图像分析平台进行组织分型及定量分析。此外，病理学家系统的、随机的选取个视野进行手工的细胞增殖指数的定量评估。
使用HALO-AI平台进行组织样本分类训练
HALO-AI提供了包括VGG、DenseNet和MinNet不同的神经网络算法适用于不同的应用场景中。
对于大鼠乳腺癌组织样本，研究人员选用DenseNet分类算法将样本分为脂肪组织、结缔组织和上皮组织3类。算法训练在11个不同的大鼠中的11个乳腺癌切片中进行，分别在每个样本切片中手工进行注释进行算法训练。在训练过程中，通过Real-timeTunning窗口实时检测算法的性能，在错误分类的区域手工添加正确的标注来纠正组织的错误分类，然后对算法进行再训练。最终，总共进行了注释，这些标注区域平均覆盖了所标注切片中每个组织类别的1.3%的面积（表1）。
对于小型猪输卵管组织样本，研究人员选用VGG分类算法将样本分为玻片背景(即透明区域)、结缔组织、上皮组织、顶端上皮细胞质（由于最初的分析显示顶端纤毛细胞膜和顶端细胞膜的气泡常被误认为是完整的阴性上皮细胞核，因此将此区域定义为顶端上皮细胞质）。从6个小型猪中共选取11个输卵管组织样本进行算法训练，在每个样本切片中进行标注并通过Real-timeTunning窗口检查算法训练的准确度，在错误分类的区域手工添加正确的标注进行再次训练。最终，所有的组织样本共标记了个注释，平均覆盖了所标注切片中每个组织类别0.8%的面积（表1）。
表1用于分割大鼠乳腺和小猪输卵管组织的HALO-AI算法标注数据量。
使用HALO平台进行细胞增殖定量评估
在每个乳腺切片中，在包含乳腺脂肪垫的所有区域手动绘制ROI区域，并使用训练好的算法对组织进行分类。随后在HALO中，特别是在通过算法分类为上皮的区域中，使用HALOAreaQuantification对BrdU+细胞和阴性细胞的核区域进行了定量。
图1大鼠乳腺组织的图像分析。A，在包含乳腺组织的乳腺脂肪垫区域周围手工绘制ROI区域；B，用EP处理19天的大鼠乳腺组织进行BrdU染色；C，HALO-AI将乳腺组织分为脂肪组织(黄色标注)、结缔组织(绿色标注)和上皮组织(红色标注)；D，在HALO-AI分类后的区域内进行BrdU阳性区域定量（红色和黄色标注）以及阴性胞核区域定量（绿色）。EP,treatedwithestradiolandprogesterone(用雌二醇和孕酮治疗)
在小型猪输卵管切片中，在每个输卵管横截面周围绘制ROI区域，使用经过训练的算法对组织进行分类。随后使用HALOAreaQuantization分析模块，在小型猪输卵管切片中被分类为上皮的区域中对Ki67+细胞和阴性细胞的核区域进行了定量。
图2Mini-pig输卵管组织中的图像分析。A，在输卵管组织周围手工绘制ROI区域；B，低增殖活性的猪输卵管组织区域。箭头表示Ki67+细胞；C，高增殖活性的猪输卵管组织区域。D，图C的区域放大显示；E，HALO-AI将猪输卵管组织玻片背景（红色标注）、结缔组织（绿色标注）、上皮组织（黄色标注）、顶端上皮细胞质（蓝色标注）；F，在HALO-AI分类后的区域内进行BrdU阳性区域定量（红色和黄色标注）以及阴性胞核区域定量（绿色）。
最后，计算每个切片中BrdU+或Ki67+面积（AF）占（a）总核面积的百分比（即增殖标志物阳性和阴性核面积的总和）或（b）占被分类为上皮组织的面积的百分比。即，在小型猪输卵管中，分类为上皮的区域不包括分类为顶端上皮细胞质的区域。
本研究中，针对不同算法训练的标注，共消耗了大约8小时。相比之下，在小型猪输卵管组织样本中，手工计算每张切片的某一部分需要花费30分钟。那么手工计算36个分区，并在需要重复计算某些分区以验证随机抽样方法的时间，大约需要20~22个小时。因此，使用HALO平台进行全组织切片的定量分析，至少是人工计算效率的2倍以上。重要的是，上述情况仅仅是在组织切片样本数量较少的情况下，HALO-AI的分析大部分时间花费在绘制标注及算法训练上，在有大量组织切片样本假设研究中，训练算法所花费的时间也大致相同。所以，基于HALO-AI的细胞增殖的定量分析，将极大地加快组织切片定量分析的效率。
结论
基于HALO-AI人工智能的算法以检测每个组织中的上皮细胞。随后通过阈值分析定量BrdU或Ki67阳性核和阴性核的面积。基于人工智能和人工计数的标记指数密切相关，并且同样很好地检测了发情周期对乳腺和输卵管上皮细胞增殖的影响，以及雌二醇和孕酮处理后大鼠乳腺中增殖的急剧增加。总之，可以使用基于人工智能的图像分析软件以可靠的方式对两个生殖组织中的上皮细胞增殖进行定量，从而避免时间和劳动密集的人工计数。这项应用研究也强调了HALO-AI在毒理病理学研究中简化检测细胞增殖活性评估的潜力。
参考文献：
HvidH,SkydsgaardM,JensenNK,etal.Artificialintelligence-basedquantificationofepithelialproliferationinmammaryglandsofratsandoviductsofgottingenminipigs[J].ToxicolPathol,,0(0)